آزمایش RFLP
پلی مورفیسم های طولی محدود شونده یا آزمایش RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) که در نتیجه تغییر در توالی DNA شناسایی شده، توسط آنزیم های محدود کننده ایجاد می شوند. این آنزیم ها، باکتریایی هستند و توسط دانشمندان برای برش مولکول های DNA در مکان های شناخته شده مورد استفاده قرار می گیرند. یک کاوشگر RFLP، یک توالی DNA نشاندار است که پس از جداسازی آن ها توسط ژل الکتروفورز با یک یا چند قطعه از نمونه DNA هضم شده هیبرید می شود. بنابراین یک الگوی بلات منحصر به فرد را برای یک ژنوتیپ خاص در یک مکان خاص نشان می دهد. از این تکنیک برای شناسایی چند شکلی های ژنتیکی (یا همان پلی مورفیسم ها) استفاده می شود.
تاریخچه RFLP
آزمایش RFLP تکنیکی است که در سال 1984 توسط دانشمند انگلیسی الک جفریس (Alec Jeffreys) در حین تحقیق در مورد بیماری های ارثی ابداع شد. از این تکنیک شگفت انگیز برای تجزیه و تحلیل الگوهای منحصر به فرد در قطعات DNA به منظور تمایز ژنتیکی بین موجودات استفاده می شود؛ این الگوهای تعداد متغیر و پشت سر هم را VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) می نامند.
تکنیک RFLP چه مراحلی دارد؟
مراحل آزمایش RFLP به شرح زیر است:
- استخراج DNA (DNA Extraction):
برای شروع این تکنیک لازم است که DNA از طریق نمونه هایی همچون خون، بزاق یا نمونه های دیگر استخراج و خالص سازی شود.
- تکه تکه شدن DNA (DNA Fragmentation)
DNA خالص شده با استفاده از اندونوکلئازهای محدود هضم می شود؛ مکان های تشخیص این آنزیم ها معمولاً 4 تا 6 جفت باز طول دارند. هر چه توالی شناسایی شده کوتاهتر باشد، تعداد قطعات تولید شده از هضم بیشتر است؛ برای مثال اگر یک توالی کوتاه از GAGC داشته باشیم که به طور مکرر در یک نمونه از DNA رخ می دهد، اندونوکلئاز محدود کننده ای که توالی GAGC را تشخیص می دهد، DNA را در هر تکرار الگوی GAGC برش خواهد داد.
- الکتروفورز ژل (Gel Electrophoresis)
قطعات محدود تولید شده در طول قطعه قطعه شدن DNA، با استفاده از ژل الکتروفورز مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند. این قطعات دارای بار منفی هستند و می توان آنها را به راحتی با الکتروفورز جدا کرد (روش الکتروفورز مولکول ها را بر اساس اندازه و بار آن ها جدا می کند). نمونه های تکه تکه شده DNA در محفظه حاوی ژل الکتروفورتیک و دو الکترود قرار می گیرند. هنگامی که یک میدان الکتریکی اعمال شود، قطعات به سمت الکترود مثبت مهاجرت می کنند و قطعات کوچکتر سریعتر در ژل حرکت می کنند و قطعات بزرگتر را پشت سر می گذارند. بنابراین نمونه های DNA به نوارهای مجزا روی ژل جدا می شوند.
- مشاهده باندها
ژل مورد نظر ما برای الکتروفورز حاوی رنگ های شب تاب هستند تا نوارهای DNA قابل مشاهده باشد.
کاربردهای آزمایش RFLP چیست؟
آزمایش RFLP از زمان اختراع خود برای چندین کاربرد آنالیز ژنتیکی استفاده شده است که برخی از این کاربردهای کلیدی در زیر ذکر شده است:
- تعیین وضعیت بیماری های ژنتیکی مانند فیبروز کیستیک در فرد.
- برای تعیین یا تأیید منبع نمونه DNA مانند آزمایش ابوت (paternity) یا تحقیقات حوزه جنایی.
- در نقشه برداری ژنتیکی برای تعیین نرخ های نوترکیبی که فاصله ژنتیکی بین جایگاه ها را نشان می دهد.
- برای شناسایی ناقل یک جهش بیماریزا در یک خانواده.
معایب روش RFLP چیست؟
از آزمایش RFLP به طور گسترده ای در تکنیک های تجزیه و تحلیل ژنوم استفاده می شود و همچنین در علوم پزشکی قانونی، پزشکی و مطالعات ژنتیکی کاربرد گسترده دارد. با این حال با ظهور فناوری های نسبتا ساده و ارزان تر پروفایل DNA مانند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، این متد تقریباً منسوخ شده است. در ادامه برخی از معایب این متد را خواهید خواند:
- روش RFLP به مراحل متعددی نیاز دارد و هفته ها طول می کشد تا نتایج مورد نظر حاصل شود، در حالی که تکنیک هایی مانند PCR می توانند توالی های DNA هدف را در عرض چند ساعت تکثیر و تعیین کنند.
- علاوه بر این، RFLP به یک نمونه DNA بزرگ نیاز دارد که جداسازی آن می تواند فرآیندی پرزحمت و زمانبر باشد. در مقابل، PCR می تواند مقادیر بسیار کمی از DNA را در عرض چند ساعت تکثیر و تقویت کند.
- متدی پر هزینه است
نویسنده و مترجم: دکتر سارا فرخی مشاور ژنتیک
